Reparo de ADN

Parte da série de biologia sobre
Genética
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Reparação de ADN é um conjunto de processos pela qual a célula identifica e corrige os danos das moléculas de DNA que codificam o seu genoma. Em células humanas, tanto atividades metabólicas normais quanto fatores ambientais (como raios UV) podem causar danos no ADN, resultando em cerca de 1 000 000 lesões moleculares individuais por dia.^[1] Muitas dessas lesões causam danos estruturais à molécula de ADN e podem alterar ou eliminar a habilidade celular para transcrição gênica. Outras lesões provocam mutações potencialmente prejudiciais no genoma celular, que afetam a sobrevivência de suas células irmãs que depois sofrem mitose. Como consequência, o processo de reparo de ADN precisa estar funcionando constantemente para resolver rapidamente os danos na estrutura do ADN.^[2][3]

A célula possui vários mecanismos para reparar os danos no ADN, que podem ou não exigir um molde para orientar a reparação e ressintetizar as partes danificadas, e podem realizar a reparação com grande precisão ou de forma mais imprecisa (o ADN não é idêntico ao original), e os segmentos de ADN podem mesmo ser perdidos. Estes mecanismos são: (1) reversão direta, que utiliza enzimas que não requerem um molde; (2) reparação por excisão, que utiliza a outra cadeia de ADN como molde para reparar quebras de cadeia simples, e pode ser realizada por reparação por excisão de bases, excisão de nucleótidos, ou reparação de incompatibilidades; (3) reparação de quebra de dupla febra (ou "fita"), que pode ser realizada por união de extremidade não homóloga, união de extremidade mediada por microhomologia, ou recombinação homóloga, e (4) síntese de translesão, que funciona durante a replicação de ADN utilizando ADN polimerases especiais.

A acumulação de danos, especificamente quebras de dupla febra ou adutos do ADN que causam a paragem da forquilha de replicação, está entre os sinais estimulatórios conhecidos por desencadear uma resposta global ao dano no ADN, dirigida à preservação das próprias células, que ativa muitas vias de reparação macromolecular, recuperação de locais danificados, tolerância ou apoptose, cujas características comuns são a indução de muitos genes, paragem do ciclo celular e inibição da mitose.

Quando os processos normais de reparação falham e a apoptose celular (morte das células danificadas) não ocorre, podem ocorrer danos irreparáveis ​​no ADN, como quebras de cadeia dupla e ligações cruzadas de ADN, ou seja, ligações cruzadas entre as duas cadeias (ou ICLs, na sua sigla em inglês: Interstrand CrossLinks).

A taxa de reparo de ADN é dependente de muitos fatores, inclusive o tipo de célula, a idade celular e o meio extracelular. Uma célula que tem acumulado uma grande quantidade de danos de ADN, ou que não repare efetivamente os danos incorridos nele, terá um dos três possíveis destinos:

1. um irreversível estado de dormência, conhecido como senescência;
2. a célula se "suicida", o que é conhecido como apoptose, ou morte celular programada;
3. carcinogênese, a formação de câncer.

A capacidade de uma célula reparar o seu ADN é vital para manter a integridade do seu genoma e, por conseguinte, para o funcionamento normal de todo o organismo. Muitos genes que inicialmente influenciavam a longevidade foram posteriormente descobertos como estando envolvidos na reparação e proteção do ADN.^[4] Os danos no ADN são propostos como uma das principais causas do envelhecimento humano. Diversas doenças genéticas hereditárias, como a progéria, são causadas por alterações em genes envolvidos na reparação do ADN.

Estudos epigenéticos demonstraram que as alterações epigenéticas nos genes de reparação do ADN têm uma influência essencial na carcinogénese. Os mecanismos de reparação do ADN devem ter surgido quando uma atmosfera rica em oxigénio surgiu na Terra no Pré-Câmbrico, causando danos oxidativos no ADN. Os processos básicos desta reparação são altamente conservados em todos os domínios da vida: bactérias, arqueias, eucariotas e até mesmo em vírus bacteriófagos.

A maioria das células no corpo primeiramente tornam-se senescentes. Então, depois de danos irreparáveis ao ADN, ocorre a apoptose. Nesse caso, a apoptose funciona como um "último recurso" prevenindo a célula de tornar-se carcinogênica ameaçando o organismo.^[4]

Quando as células tornam-se senescentes, alterações na biossíntese fazem com que funcionem menos eficientemente. A capacidade do reparo de ADN de uma célula é vital para a integridade do genoma e, consequentemente, para o seu funcionamento normal e o do organismo. Sabe-se que vários genes que inicialmente foram demonstrados como influentes na longevidade estão envolvidos em proteção e reparo aos danos no ADN.^[5][6]

Em 2015 o Prêmio Nobel de Química foi concedido Tomas Lindahl, Paul Modrich e Aziz Sancar pelos estudos mecanicísticos para reparo de DNA.^[5][6]

Os danos no ADN, devidos aos fatores ambientais e dos processos metabólicos celulares normais, ocorrem a uma taxa de 10 000 a 1 000 000 lesões por célula diariamente.^[1] Ainda assim, várias outras fontes de danos podem elevar ainda mais essa taxa. Enquanto isso constitui apenas 0,000165% do genoma humano, 3 000 000 000 (3 bilhões) de bases, uma única lesão não reparada em um gene relacionado ao câncer (como o gene supressor de tumor) pode ter consequências catastróficas ao indivíduo.

A maioria dos danos no ADN afectam a estrutura primária da dupla-hélice; isto é, as próprias bases são modificadas quimicamente. Estas modificações podem, por sua vez, alterar a estrutura helicoidal das moléculas^[7] ao introduzir ligações químicas não nativas ou adutos volumosos que não se encaixam bem na estrutura da dupla-hélice padrão.^[8] O ADN está superenrolado e associado a proteínas de "empaquetamento" chamadas histonas (em eucariotas), e ambas as estruturas são vulneráveis aos efeitos dos danos no ADN, e devem ser reparadas.^[9] A própria modificação de histonas faz parte dos mecanismos de reconhecimento dos danos e reparação do ADN.^[10]

Em humanos, e células eucarióticas em geral, o DNA é encontrado em duas localidades na célula: no núcleo (nDNA) e dentro das mitocôndrias. DNA nuclear existe em larga escala em estruturas agregadas conhecidas como cromossomos, os quais são compostos de DNA e, envolvidas por proteínas chamadas histonas. Sempre que a célula precisa expressar a informação genética codificada no nDNA é requerida uma região cromossômica não-revelada, genes localizados lá são expressos e a região é condensada de volta a conformação quiescente. O DNA mitocondrial (mtDNA) é localizado dentro da mitocôndria; existem em múltiplas cópias e isso é também fortemente associado com o número de proteínas para formar um complexo conhecido como nucleoide. Dentro da mitocôndria, espécies reativas de oxigênio (ERO) ou radicais livres, são produtos da constante produção de trifosfato de adenosina (ATP) via fosforilação oxidativa, criam um ambiente altamente oxidativo que é conhecido por danos no mtDNA.^[11]

Em condições de exercício físico intenso ou prolongado, a produção mitocondrial de EROs aumenta substancialmente, elevando o risco de danos ao mtDNA. Pesquisas recentes sugerem que intervenções com antioxidantes exógenos, como a melatonina, podem atenuar esses danos ao fortalecer os sistemas antioxidantes mitocondriais ^[12].

Os danos no ADN podem ser divididos em dois tipos principais:^[13]

1. Danos endógenos originados por causas internas como:
   1. Mutações espontâneas como as causadas pelo ataque de espécies reativas do oxigénio produzidas a partir de subprodutos metabólicos normais, especialmente no processo de desaminação oxidativa.^[14]
   2. Também inclui os erros de replicação.
2. Danos exógenos causados por agentes externos como:
   1. Radiação ultravioleta [UV 200-400 nm] do sol.^[14]
   2. Radiações de outras frequências, como raios X e gama.^[14]
   3. Hidrólise^[15] ou alteração térmica.^[16]
   4. Certas toxinas de plantas.^[17]
   5. Compostos químicos mutagénicos artificiais, especialmente os aromáticos, que atuam como agentes intercalantes do ADN.^[18]
   6. Vírus.^[19]

A replicação do ADN danificado antes da divisão celular pode causar a incorporação de bases incorretas na cadeia complementar do ADN em frente das bases danificadas. As células-filhas que herdam estas bases incorretas carregam mutações, pelo que a sequência de ADN original é irrecuperável, exceto no raro caso de ocorrer uma mutação retrógrada (isto é, uma mutação pontual que restaura a sequência original e, portanto, o fenótipo original^[20]), por exemplo por conversão génica.

Há vários tipos de danos no ADN devidos a processos celulares endógenos:

1. Oxidação de bases (por exemplo, geração de 8-oxo-7,8-di-hidroguanina) e geração de interrupções da fita de ADN causadas por espécies reativas do oxigénio.^[21][22]
2. Alquilação de bases (usualmente metilação), como a formação de 7-metilguanina, 1-metiladenina, 6-O-metilguanina.^[23]
3. Hidrólise de bases, como a desaminação, despurinação e despirimidinação.^[24]
4. Formação de adutos volumosos (como os adutos benzo[a]pireno diol epóxido-dG ou aristolactam I-dA).^[13][25]
5. Discordância na complementaridade de bases, devido a erros na replicação do ADN, na qual é colocada numa fita de ADN de nova formação uma base errada, ou é omitida uma base ou é inserida indevidamente uma base extra.^[13]
6. Danos de monoadutos causados por alterações numa só base nitrogenada do ADN.^[26]
7. Danos de diadutos.^[26] Os danos causados por agentes exógenos ocorrem de muitas formas. Alguns exemplos são: # A luz UV-B causa a formação de ligações cruzadas entre bases timina e citosina adjacentes, criando dímeros de pirimidina. Isto denomina-se danos diretos ao ADN.^[27]
8. A luz UV-A cria principalmente radicais livres. Os danos causados pelos radicais livres denominam-se danos indiretos ao ADN.^[28]
9. As radiações ionizantes como as geradas pela radioatividade ou os raios cósmicos causam roturas nas fitas do ADN. A radiação ionizante de nível intermédio pode induzir danos irreparáveis no ADN (que causam erros na replicação e transcrição que são um passo necessário para a formação de neoplasias ou podem desencadear interações virais) que originam um envelhecimento prematuro e cancros.^[29]
10. A alteração térmica a temperaturas elevadas aumenta o grau de despurinação (perda de bases púricas no ADN) e roturas de uma fita. Por exemplo, a despurinação hidrolítica dá-se nas bactérias termófilas, que crescem em fontes termais a 40-80 °C.^[16][30] A taxa de despurinação (300 resíduos de purina por genoma e por geração) é demasiado alta nestas espécies para ser reparada pela maquinaria normal de reparação, pelo que não se pode descartar a possibilidade de que seja uma resposta adaptativa.
11. Compostos químicos industriais como o cloreto de vinilo^[31] e o peróxido de hidrogénio^[32], e compostos químicos ambientais como hidrocarbonetos aromáticos policíclicos^[33] que se encontram no fumo, fuligem e alcatrão, criam uma grande diversidade de adutos do ADN, como etenobases, bases oxidadas, fosfotriésteres alquilados e ligações cruzadas no ADN, entre outros.^[34] Outra maneira de classificar os danos é em induzidos e espontâneos. Os danos por luz UV, alquilação/metilação, por raios X e danos oxidativos são exemplos de danos induzidos. Os danos espontâneos incluem a perda de uma base, desaminação, deformações nos anéis de açúcares e alterações tautoméricas.^[13]

Nas células humanas, e, em geral, nas células eucariotas, o ADN encontra-se em duas localizações celulares: dentro do núcleo e dentro das mitocôndrias. O ADN nuclear (ADNn) está na forma de cromatina durante os estados não replicativos do ciclo celular e condensa-se em estruturas agregadas chamadas cromossomas durante a divisão celular. Em ambos os estados o ADN está muito compactado e enrolado à volta de grupos de proteínas histonas. Quando uma célula precisa de expressar a informação genética codificada no seu ADNn, a região cromatínica envolvida é desenrolada, e os genes localizados ali são expressos, e depois a região volta a condensar-se à sua conformação anterior.^[35] O ADN mitocondrial (ADNmt) está localizado dentro das mitocôndrias, é circular e bicatenário, dele há muitas cópias, e também está estreitamente associado com várias proteínas com as quais forma um complexo chamado nucleoide. Dentro da mitocôndria as espécies reativas do oxigénio (ROS), ou radicais livres, que são subprodutos da constante formação de ATP por fosforilação oxidativa, criam um ambiente muito oxidante que se sabe produzir danos no ADNmt. Uma enzima fundamental para contrariar a toxicidade destas espécies é a superóxido dismutase, a qual está presente tanto em mitocôndrias como no citoplasma das células eucariotas.^[36][37][38]

A senescência, que é um processo irreversível no qual a célula já não se divide, é uma resposta protetora ao encurtamento dos telómeros (extremos cromossómicos). Os telómeros são longas regiões formadas por ADN não codificante repetitivo que formam uma espécie de topo no extremo dos cromossomas, mas que sofrem uma degradação parcial (pelo que se encurtam) cada vez que a célula se divide (ver limite de Hayflick).^[39] O estado de quiescência é um estado irreversível de dormência celular que não está relacionado com danos no ADN (ver ciclo celular). A senescência nas células pode servir como uma alternativa funcional à apoptose em casos onde é necessária a presença física de uma célula por razões espaciais para o organismo,^[40] o qual serve como mecanismo de "último recurso" para impedir que uma célula com ADN danificado se replique inapropriadamente na ausência de uma sinalização celular que indique crescimento. As divisões celulares não reguladas podem levar à formação de um tumor (ver cancro), potencialmente mortal para o organismo. Portanto, a indução da senescência e a apoptose é considerada parte de uma estratégia de proteção contra o cancro.^[41]

É importante distinguir entre os danos de DNA e mutação, os dois principais tipos de erros no DNA, pois são fundamentalmente diferentes. Os danos são anormalidades físicas na molécula, como as quebras das ligações simples e duplas, os resíduos de 8’-oxo-deoxiguanosina e adutos de hidrocarbonetos aromáticos policíclicos. Eles podem ser causados pela recodificação por enzimas, e, também, eles podem ser corretamente reparados se a informação redundante, como as sequências não danificadas na extremidade dos complementos de DNA ou em um cromossomo homólogo, é disponível para cópia. Se a célula retém os danos de DNA, a transcrição do gene pode ser evitada, e, também, a tradução dentro da proteína pode também ser bloqueada. A replicação pode também ser bloqueada ou a célula pode morrer.^[13][42]

Em contraste dos danos de DNA, uma mutação é uma alteração na base da sequência do DNA. Uma mutação não pode ser recodificada por enzimas, uma vez que a alteração da base é presente de ambas as extremidades de DNA, e, também, uma mutação não pode ser reparada. Em nível celular, as mutações podem causar alterações na função e na regulação protéica. As mutações são replicadas quando a célula replica. Na população das células, as mutantes podem crescer ou decrescer de acordo com a freqüência dos efeitos da mutação e na habilidade da célula de sobreviver e reproduzir. Apesar das diferenças distintas de uma para outra, os danos de DNA e as mutações são relatadas porque os danos de DNA muitas vezes causam erros na síntese de DNA durante a replicação ou reparação; estes erros é a maior fonte de mutações.^[43]

Dadas as propriedades que os danos no ADN e as mutações têm, os danos no ADN são um problema especial em células que não se dividem ou que se dividem lentamente, nas quais os danos não reparados tenderão a acumular-se com o tempo. Por outro lado, em células que se dividem rapidamente, os danos no ADN não reparados que não matam a célula ao bloquearem a replicação tenderão a causar erros de replicação e, portanto, mutações. A grande maioria das mutações que não são neutras nos seus efeitos, são deletérias para a sobrevivência da célula. Assim, numa população de células que compõem um tecido com células em replicação, as células mutantes tenderão a perder-se. Porém, certas mutações raras que proporcionam uma vantagem para a sobrevivência tenderão a expandir-se clonalmente à custa das células vizinhas normais do tecido. Esta vantagem para a célula é desvantajosa para o conjunto do organismo, porque essas células mutantes podem dar origem a um cancro. Deste modo, como os danos no ADN em células que se dividem frequentemente dão origem a mutações, são uma causa importante de cancro. Ao contrário do anterior, os danos no ADN em células que não se dividem frequentemente são provavelmente uma causa importante do envelhecimento.^[43]

Células não podem tolerar danos no DNA que comprometam a integridade e a acessibilidade das informações essenciais do genoma (mas, células permanecem superficialmente funcionais quando os então chamados genes não-essenciais são perdidos ou danificados.). Dependendo do tipo de dano infligido na estrutura duplo-helicoidal de DNA, uma variedade de estratégias de reparo tem sido envolvidos para restaurar informações perdidas. Como modelos de restauração, as células utilizam uma fita complementar não modificada de DNA ou do cromossoma-irmão. Sem acesso a informação modelo, o reparo de DNA é propenso a erros (mas isso pode ser uma via padrão: muitos danos na fita dupla nas células de mamíferos, e.g: são reparados sem ajuda de um modelo; ver mais adiante).^[44][45]

Os danos no DNA alteram a configuração espacial da hélice e tais alterações podem ser detectadas pela célula. Uma vez o dano seja localizado, moléculas específicas de reparo de DNA são enviadas ao local e se ligam à região ou nas proximidades do local do dano, incluindo outras moléculas para ligar e formar um complexo que habilita o reparo a agir no local.^[45] Os tipos de moléculas envolvidas e o mecanismo de reparo que é mobilizado depende:

1. Do tipo de dano no DNA que está em jogo
2. Se a célula entrou no estado de senescência
3. A fase do ciclo celular que a célula esteja

Quando somente uma das duas fitas de dupla hélice tem defeito, a outra fita pode ser usada como modelo para guiar a correção da fita danificada. Para reparar os danos de uma das duas febras emparelhadas do ADN, existem vários mecanismos de reparação por excisão que removem o nucleótido danificado e o substituem por outro nucleótido correto que seja complementar ao que se encontra na febra do ADN não alterada.^[46] Estes mecanismos são:

1. A Reparação por excisão de bases (BER) repara os danos que afetam uma única base nitrogenada através da ação de enzimas chamadas glicosilases.^[47] Estes enzimas eliminam uma única base nitrogenada, criando um sítio purínico ou apirímidico (sítio AP).^[47] Os enzimas AP endonucleases fazem uma incisão ou corte no esqueleto da molécula de ADN danada no sítio AP. De seguida, a ADN polimerase remove a região danada utilizando a sua atividade exonuclease 5'-3' e sintetiza corretamente a nova fita utilizando a fita complementar como molde.^[47]

1. A Reparação por excisão de nucleótidos (NER) repara o ADN danado, que geralmente consiste num dano volumoso que distorce a hélice, como pode ser uma dimerização de pirimidina causada pela luz UV. As regiões danadas são eliminadas em fita de 12 a 24 nucleótidos de comprimento, num processo em três fases, que consiste no reconhecimento dos danos, a excisão do ADN danado tanto a montante como a jusante do ponto do dano por meio de uma endonuclease, e a ressintese da região de ADN removida.^[48] A NER é um mecanismo de reparação muito conservado evolutivamente e é utilizado em quase todas as células eucariotas e procariotas.^[48] Em procariotas, a NER é realizada por enzimas Uvr.^[48] Em eucariotas, estão implicadas muito mais proteínas, ainda que a estratégia geral seja a mesma.^[48]

1. Os sistemas de reparação de incompatibilidades (MMR) na complementaridade de bases estão presentes essencialmente em todas as células para corrigir erros que não são corrigidos por correção de erros. Estes sistemas consistem em pelo menos duas proteínas. Uma deteta a discordância na complementaridade, e a outra recruta uma endonuclease que excinde a febra de ADN de nova síntese perto da região onde ocorreu o dano. Em E. coli, as proteínas implicadas são as proteínas de classe Mut. Isto é seguido pela remoção da região danada por uma exonuclease, a ressintese pela ADN polimerase e a selagem do corte por uma ADN ligase.^[49]

As quebras de dupla fita (em português, QDFs), nas quais num ponto há um corte que afeta ambas as fitas da dupla hélice, são especialmente perigosas para a célula porque podem originar rearranjos genómicos. Há três mecanismos que reparam as quebras de dupla fita (em inglês DSBs): união de extremidade não-homóloga (em inglês NHEJ), união de extremidades mediada por microhomologia (em inglês MMEJ) e recombinação homóloga.^[46] O investigador P. V. Acharya assinalou que as quebras de dupla fita e uma "ligação por ligações cruzadas que ligue ambas as fitas no mesmo ponto é irreparável porque nenhuma das fitas pode servir como molde para fazer o reparo. A célula morrerá na seguinte mitose ou em raros casos, mutará."^[2][3]

Na união de extremidades não homólogas (NHEJ), a DNA ligase IV, uma DNA ligase especializada que forma um complexo com o cofator XRCC4, é encarregada de unir diretamente as duas extremidades.^[50] Para guiar um reparo exato, a NHEJ depende de curtas sequências homólogas chamadas microhomologias presentes em caudas de fita simples das extremidades do ADN que vão ser unidas. Se estas caudas que sobressaem são compatíveis em bases, o reparo é geralmente exato.^{[51][52][53][54]} A NHEJ pode também introduzir mutações durante o reparo. A perda de nucleótidos danados no sítio de quebra pode originar deleções, e a união de extremidades discordantes (não complementares) causa translocações. A NHEJ é especialmente importante antes que a célula replique o seu ADN, já que não há disponível um molde para o reparo por recombinação homóloga. Há vias da NHEJ alternativas ou redundantes (de "back up") em eucariotas superiores.^[55] Além do seu papel como vigilante do genoma, a NHEJ é necessária para unir quebras de dupla fita que acabam em gancho induzidas durante a recombinação V(D)J, que é o processo que gera diversidade nos recetores de células B e T no sistema imunitário de vertebrados.^[56]

A MMEJ começa com uma resseção de extremidades de curto alcance feita pela nuclease MRE11 a cada lado de uma quebra de dupla fita para revelar regiões de microhomologia.^[57] Nos seguintes passos^[58] é necessário a PARP1 e pode ser um passo inicial na MMEJ. Há um emparelhamento de regiões de microhomologia seguida do recrutamento da endonuclease FEN1 (flap structure-specific endonuclease 1) para que elimine as abas que sobressaem. Depois produz-se o recrutamento de XRCC1–LIG3 no sítio para ligar as extremidades do ADN, o que origina um ADN intacto.

As quebras de dupla hélice no ADN em células de mamíferos são reparadas primariamente por recombinação homóloga (HR) e união de extremidades não homólogas (NHEJ).^[59] Num sistema in vitro, a MMEJ tem lugar nas células de mamíferos a um nível equivalente a de 10 a 20% da HR quando estão disponíveis ambos os mecanismos.^[57] A MMEJ está sempre acompanhada de uma deleção, pelo que a MMEJ é uma via mutagénica de reparo do ADN.^[60]

A recombinação homóloga requer a presença de uma sequência idêntica ou quase idêntica para a usar como molde para o reparo da quebra. A maquinaria enzimática responsável por este processo de reparo é quase idêntica à responsável pelo sobrecruzamento cromossómico que tem lugar durante a meiose. Esta via permite que os cromossomas danados sejam reparados usando como molde uma cromátide irmã (disponível na fase G2 da interfase depois da replicação do ADN) ou um cromossomo homólogo. As quebras de dupla fita causadas pela maquinaria de replicação que tenta sintetizar através de uma quebra de fita simples ou lesão não reparada causam o colapso da forquilha de replicação e são reparadas normalmente por recombinação.^[61][62]

As topoisomerases introduzem quebras tanto de fita simples como dupla quando originam a mudança do estado de super-enrolamento do ADN, o qual é especialmente comum em regiões perto da forquilha de replicação. Essas quebras não são consideradas danos no ADN porque são um intermediário natural no mecanismo bioquímico das topoisomerases e são imediatamente reparadas pelas enzimas que as criaram.^[63]

Uma equipa de investigadores croatas e franceses expuseram a radiações a bactéria Deinococcus radiodurans originando muitos fragmentos do seu genoma para estudarem o mecanismo de reparo das quebras de dupla fita do ADN nesse organismo. Encontraram um novo mecanismo de reparo, chamado "annealing de fitas dependente de síntese estendida" (ou ESDA, do inglês extended synthesis-dependent strand annealing), na qual são necessárias pelo menos duas cópias do genoma, com quebras aleatórias no ADN. Os fragmentos com homologias que se sobrepõem são utilizados para sintetizar as fitas complementares que faltam, o que é catalisado pela DNA polimerase I, que estende a fita mais do que o normal. Os fragmentos assim formados têm a particularidade de que apresentam extremidades coesivas, que facilmente podem fazer o annealing (unir-se por emparelhamento complementar de bases) e ligar-se a outros fragmentos complementares de ADN do conjunto, originando fragmentos intermediários maiores. No passo final para formar cromossomas circulares há um sobrecruzamento por meio de recombinação homóloga dependente de RecA.^[64]

A síntese translesão (TLS) é um processo que permite tolerar danos no ADN para que a maquinaria de replicação do ADN possa replicar para lá dos pontos onde há lesão no ADN, como dímeros de timina ou sítios AP.^[65] Funciona trocando as ADN polimerases normais por polimerases translesão especializadas (isto é, as ADN polimerases IV ou V, pertencentes à família de polimerases Y), que costumam ter sítios ativos maiores que podem facilitar a inserção de bases situadas em frente de nucleótidos danados. Esta troca de polimerases crê-se que é mediada, entre outros fatores, pela modificação pós-traducional do fator de processividade da replicação PCNA. As polimerases de síntese translesão costumam ter uma baixa fidelidade (alta propensão a inserir bases erradas) ao copiarem moldes não danados em relação às polimerases normais. Contudo, muitas são extremamente eficazes na hora de inserir as bases corretas em frente aos locais onde há tipos específicos de danos. Por exemplo, a Pol η (eta) realiza um contorno ou bypass livre de erros de lesões induzidas por irradiação ultravioleta, enquanto que a Pol ι (iota) introduz mutações nesses sítios. A Pol η adiciona a primeira adenina por meio do fotodímero T^T usando emparelhamentos de bases de Watson e Crick e a segunda adenina é adicionada na sua conformação syn usando emparelhamento de bases de Hoogsteen.^[66][67]

De uma perspetiva celular, o risco de introduzir uma mutação pontual durante a síntese translesão pode ser preferível a utilizar mecanismos mais drásticos de reparo do ADN, que podem causar grandes aberrações cromossómicas ou a morte celular. Em resumo, o processo envolve polimerases especializadas que reparam ou dão um contorno (bypass) à lesão em locais onde a replicação do ADN fica emperrada. Por exemplo, a ADN polimerase eta humana pode superar os pontos com lesões do ADN complexas como podem ser ligações cruzadas intra-fita guanina-timina (G[8,5-Me]T).^[68] P. Raychaudhury e A. Basu^[69] estudaram a toxicidade e a mutagénese da mesma lesão em E. coli replicando um plasmídeo com a modificação G[8,5-Me]T em E. coli com knockouts específicos de ADN. A viabilidade era muito baixa numa estirpe que carecia de pol II, pol IV e pol V, que são as três ADN polimerases induzíveis SOS, o que indica que a síntese translesão é realizada principalmente por estas ADN polimerases especializadas.

O antigénio nuclear de célula proliferante (PCNA) proporciona uma plataforma de bypass para estas polimerases. Em circunstâncias normais, a replicação do ADN é feita com o PCNA ligado a polimerases. Num sítio de lesão, o PCNA é ubiquitinado, ou modificado, pelas proteínas RAD6/RAD18 para proporcionar uma plataforma para que as polimerases especializadas contornem o ponto da lesão e recomecem a replicação do ADN.^[70][71] Depois da síntese translesão, é preciso fazer uma extensão da fita. Esta extensão pode ser levada a cabo por uma polimerase replicativa se a síntese translesão não apresentar erros, como no caso da Pol η, embora se a síntese translesão originar um erro no emparelhamento de bases, é necessária uma polimerase especializada para fazer esta extensão, que é a Pol ζ. A Pol ζ tem a característica exclusiva de que pode estender discordâncias no emparelhamento de bases terminais, enquanto que outras polimerases mais processivas não podem. Assim que quando se encontra uma lesão e a forquilha de replicação fica detida, o PCNA muda de estar ligado a uma polimerase processiva para estar ligado a uma polimerase de síntese translesão (TLS) como Pol ι para reparar a lesão, depois o PCNA pode mudar para a Pol ζ para estender a discordância na complementaridade de bases, e finalmente, o PCNA muda de novo para a polimerase processiva para continuar com a replicação.^[67]

As células expostas à radiação ionizante, raios ultravioleta ou a certos compostos químicos sofrem em muitos locais do seu ADN lesões volumosas e quebras de dupla febra. Além disso, os agentes que danificam o ADN podem danificar também outras moléculas como proteínas, carboidratos, lípidos e ARN. A acumulação de danos, especificamente de quebras de dupla febra ou adutos do ADN que fazem com que a forcada de replicação fique parada, estão entre os sinais estimuladores que se sabe desencadearem uma resposta global aos danos no ADN.^[72] A resposta global aos danos é uma ação dirigida à preservação das próprias células e ativa muitas vias de reparação macromolecular, contorno dos pontos lesionados, tolerância, ou apoptose. As características comuns da resposta global são a indução de muitos genes, a paragem do ciclo celular e a inibição da mitose.

Quando ocorrem danos no ADN, são ativados os pontos de controlo (checkpoints) do ciclo celular.^[73] A ativação dos pontos de controlo para o ciclo celular e dá tempo à célula para reparar os danos antes de esta continuar a dividir-se. Os pontos de controlo de danos no ADN funcionam nos limites entre fase G1/S e fase G2/M. Também existe um ponto de controlo dentro da fase S. A ativação de pontos de controlo é controlada por duas quinases mestras, a ATM e ATR. A quinase ATM responde às quebras de dupla febra do ADN e altera a estrutura da cromatina,^[74] enquanto que a ATR responde principalmente à presença de forcadas de replicação paradas. Estas quinases fosforilam alvos situados a jusante numa cascata de transdução de sinais, o que finalmente faz com que o ciclo celular pare. Também se identificou uma classe de proteínas mediadoras do ponto de controlo, como BRCA1, MDC1 e 53BP1.^[75] Estas proteínas parecem ser necessárias para transmitir o sinal de ativação do ponto de controlo a proteínas situadas a jusante da via.

As proteínas dos pontos de controlo podem ser divididas em quatro grupos: proteína quinases do tipo PI3K (fosfatidilinositol 3-quinase), grupo similar a PCNA (antigénio nuclear de célula proliferante), e duas serina/treonina(S/T) quinases e os seus adaptadores. São essenciais em todas as respostas de pontos de controlo induzidos por danos no ADN um par de grandes proteína quinases que pertencem ao primeiro grupo das proteína quinases de tipo PI3K, chamadas quinases ATM (ATM) e ATR (relacionadas com a ataxia e rad), cujas sequências e funções foram bem conservadas na evolução. Todas as respostas a danos no ADN requerem a ATM ou a ATR porque estas têm a capacidade de se ligarem aos cromossomas no sítio onde ocorreu o dano no ADN, juntamente com proteínas acessórias que são plataformas sobre as quais podem ser montados os componentes da resposta aos danos do ADN e os complexos de reparação do ADN.^[76]

Um importante alvo situado a jusante da ATM e a ATR é p53, já que esta proteína é necessária para induzir a apoptose após um dano no ADN.^[77] O Inibidor da quinase dependente de ciclina p21 é induzido tanto por mecanismos dependentes de p53 como independentes de p53 e pode parar o ciclo celular nos pontos de controlo G1/S e G2/M desativando os complexos ciclina/quinase dependente de ciclina.^[78]

A Resposta SOS consiste nas alterações na expressão génica que ocorrem em Escherichia coli e outras bactérias em resposta a grandes danos no ADN. O sistema SOS procariota é regulado por duas proteínas chave: LexA e RecA. O homodímero LexA é um repressor transcricional que se liga a sequências operadoras normalmente denominadas caixas SOS. Em Escherichia coli é sabido que LexA regula a transcrição de aproximadamente 48 genes incluindo os genes lexA e recA.^[79] A resposta SOS está muito espalhada entre o domínio Bacteria, mas está quase sempre ausente em certos filos bacterianos, como o das espiroquetas.^[80] Os sinais celulares mais comuns que ativam as respostas SOS são regiões de ADN de cadeia simples, que se originam em forcadas de replicação paradas ou quebras de dupla febra, que são processadas pela ADN helicase para separar as duas febras do ADN.^[72] No passo de iniciação, a proteína RecA liga-se ao ADN de cadeia simples numa reação impulsionada pela hidrólise do $\text{ATP}$, criando filamentos RecA–ADN de cadeia simples. Os filamentos RecA–ADN de cadeia simples ativam a atividade de auto protease de LexA, o que leva finalmente à ocorrência da excisão do dímero LexA, seguida da degradação de LexA. A perda do repressor LexA induz a transcrição dos genes SOS e permite uma indução de sinais, inibição da divisão celular e um aumento dos níveis de proteínas responsáveis pelo processamento dos danos.

Em Escherichia coli, as caixas SOS têm sequências de 20 nucleótidos de comprimento situadas perto de promotores com estrutura palindrómica e um alto grau de conservação de sequências. Noutras classes e filos bacterianos, a sequência das caixas SOS varia consideravelmente, e apresenta diferente comprimento e composição, mas está sempre muito conservada e é um dos sinais curtos mais fortes do genoma.^[80] O alto conteúdo informativo das caixas SOS permite a ligação diferencial de LexA a diferentes promotores e permite uma correta temporização da resposta SOS. Os genes de reparação de lesões são induzidos no início da resposta SOS. As polimerases translesão com tendência ao erro, por exemplo, UmuCD'2 (também chamada ADN polimerase V), são induzidas posteriormente como um último recurso.^[81] Uma vez que os danos no ADN são reparados ou contornados utilizando polimerases ou por meio de recombinação, a quantidade de ADN de cadeia simples nas células baixa. Ao diminuir a quantidade de filamentos RecA, desce a atividade de excisão do homodímero LexA, que depois se liga às caixas SOS perto dos promotores e restaura a expressão génica normal.

As células eucariotas expostas a agentes que danificam o ADN também ativam vias defensivas importantes ao induzirem muitas proteínas implicadas na reparação do ADN, o controlo do ponto de controlo do ciclo celular e o tráfego e degradação de proteínas. Esta resposta transcricional em todo o genoma é muito complexa e está muito regulada, o que permite uma resposta coordenada aos danos. A exposição de células de leveduras Saccharomyces cerevisiae a agentes que danificam o ADN dá lugar a perfis transcricionais sobrepostos mas diferentes. As semelhanças com a resposta ao choque ambiental indicam que existe uma via de resposta ao stresse global geral a nível de ativação transcricional. Em contraste, diferentes tipos de células humanas respondem aos danos de maneira diferente, o que indica a ausência de uma resposta global comum. A provável explicação desta diferença entre as leveduras e as células humanas pode estar na heterogeneidade das células de mamífero. Num animal, há diferentes tipos de células que estão distribuídas em distintos órgãos nos quais evoluíram diferentes sensibilidades aos danos no ADN.^[82]

Em geral, a resposta global aos danos no ADN implica a expressão de múltiplos genes responsáveis pela reparação pós-replicação, a recombinação homóloga, a reparação por excisão de nucleótidos, o ponto de controlo de danos no ADN, a ativação transcricional global, genes que controlam a degradação do ARNm e muitos outros. Quando uma célula sofre uma grande quantidade de danos, esta opta entre sofrer apoptose e morrer ou sobreviver à custa de viver com um genoma modificado. Um aumento na tolerância aos danos pode levar a um aumento da proporção de sobrevivência que permitirá a acumulação de uma maior quantidade de mutações. As Rev1 de leveduras e a polimerase $\eta$ humana são membros da família Y de ADN polimerases translesão presentes durante a resposta global aos danos no ADN, e são responsáveis por um aumento da mutagénese durante a resposta global aos danos no ADN em eucariotas.^[72]

Quando as células ficam velhas, a quantidade de danos de DNA acumula-se de tal forma que se sobrepõe a capacidade de reparo resultando numa redução da síntese proteica. As proteínas nas células são usadas para numerosas funções vitais, as células se tornam gradualmente prejudicadas e posteriormente morrem. Quando células suficientes num órgão chegam até este estado, o órgão por si só se torna comprometido e os sintomas de doença começam a se manifestar. Estudos experimentais em animais, onde genes associados ao reparo de DNA foram silenciados, resultaram na aceleração do envelhecimento, manifestação precoce da idade relativa às doenças e susceptibilidade aumentada ao câncer. Em estudos onde a expressão de certos genes relacionados a reparos de DNA foi aumentado, resultou-se em expectativa de vida expandida e resistência a agentes carcinogênicos em células em cultura.

Se a taxa de danos no DNA exceder a capacidade da célula em repará-los, o acúmulo de erros pode subjugar a célula e resultar em senescência, apoptose ou câncer, dependendo do número de danos moleculares, quais genes foram atingidos e quais e o número de mecanismos de reparação em atividade. Doenças herdadas associadas à ausência de reparo de DNA funcionante resultam em envelhecimento prematuro (e.g. Síndrome de Werner) e sensibilidade aumentada a carcinógenos (e.g. Xeroderma pigmentosum). Estudos em animais, onde genes de reparo de DNA são impedidos de funcionar, perfis similares dessas doenças são observados.

Em outra via, organismos com sistemas melhorados de DNA como a bactéria Deinococus radiodurans (também conhecida por Conan, o Bárbaro a bactéria foi listada no Guiness Book por ser a bactéria mais resistente já conhecida, conseguindo resistir a dosagens de radiação-gama mil vezes mais altas que as letais para seres humanos), exibem resistência notável à radioatividade devido às suas enzimas serem hábeis a conseguir taxas rápidas e incomuns para manter o DNA reparado, mesmo sob altas doses de radiação gama, e devido a isso, ela possui consigo 10 cópias de seu genoma. Em humanos, centenários japoneses tem sido achados como tendo em comum o genótipo mitocondrial, o qual os predispõem a reduzir os danos em DNA mitocondrial nessas organelas. Estudos em fumantes têm indicado que pessoas com mutação têm em suas causas a menor expressão de um poderoso reparo de DNA associado ao gene hOGG1, a vulnerabilidade a câncer do pulmão e a outros casos de câncer tem aumentado. Polimorfismos simples de nucleotídeos (em inglês, SNP - Single nucleotide polymorphism) associados com essa mutação podem ser clinicamente detectados.

Doenças crônicas podem ser associados com aumento dos danos no DNA. Por exemplo, a fumaça do cigarro causa danos oxidativos ao DNA e outros componentes de células do coração e fígado, resultando na formação de adultos de DNA (moléculas que destroem o DNA). Danos no DNA podem agora serem mostrados como fator causal de doenças que variam desde arteriosclerose até o mal de Alzheimer, onde pacientes tem menor capacidade de reparo de DNA nas células nervosas. Danos no DNA mitocondrial podem também estar implicados em numerosas doenças.

Certos genes são conhecidos por influenciar a variação na expectativa de vida de uma população de organismos. Estudos em organismos-modelos como leveduras, vermes, moscas e ratos têm identificado genes simples, os quais quando modificados, poderiam dobrar a expectativa de vida (e.g.: uma mutação no gene-1 do nematódeo “Caenorhabditis elegans”). Esses genes são conhecidos por estarem associados especificamente a outras funções celulares diferentes do reparo de DNA, mas quando as vias que eles influenciam são seguidas ao seu destino final, foi observado que eles mediam uma das três funções, a saber:

1. Aumento na taxa de reparo de DNA
2. Aumento na taxa de produção de antioxidantes
3. Decréscimo na taxa de produção de oxidantes

Taxas de reparos de DNA desempenham um papel vital na escala celular de doenças (não-infecciosas), envelhecimento e na escala evolucionária populacional. Duas importantes relações foram estabelecidas:

1. Taxa de reparos de DNA e mutação
2. Taxa de reparos de DNA e envelhecimento

Como mutação está diretamente relacionada à evolução, um novo modo de observação dessa relação entre evolução e envelhecimento emerge. É aparente que todos os mecanismos de mutação provêem o genoma à plasticidade a adaptação, e é também responsável por desestabilizá-lo fazendo-o, assim, vulnerável ao envelhecimento e a doenças. São organismos sujeitos a doença e ao envelhecimento primariamente porque a mutação é o guia primário da evolução? Essas questões permanecem numerosas e contendedoras que as teorias sobre o envelhecimento têm oferecido.

Um vasto número de evidências correlaciona danos de DNA à morte e às doenças. Como indicado por novos estudos sobre superexpressão, o aumento da atividade de algumas enzimas de reparo de DNA pode diminuir a taxa de envelhecimento e doença. Esse modo resulta num desenvolvimento de intervenções que podem adicionar muitos anos saudáveis e livres de doenças ao envelhecimento populacional. Nem todas as enzimas de reparo de DNA são benéficas quando seus genes estão superexpressos, porém. Algumas enzimas de reparo de DNA podem introduzir novas mutações no DNA sadio. Reduzida especificidade de substrato bioquímico pode estar implicado nesses erros.

Procedimentos tais como a quimioterapia e a radioterapia agem para sobrepujar a capacidade de reparo de DNA celular para resultar na morte celular. Células que são capazes de se dividirem rapidamente, assim como o câncer, são preferencialmente afetadas. Esse efeito colateral é que outras células não-cancerosas, mas de capacidade de divisão similar, assim como as células-tronco em medula óssea também são afetadas. Modernos tratamentos de câncer tentam localizar o dano no DNA de células e tecidos somente associados a câncer.

Para usos terapêuticos do reparo de DNA, o desafio é descobrir particularmente quais enzimas de reparo de DNA que exibem maior especificidade para locais de dano, então a superexpressão irá levar à melhora da função de reparo de DNA. Uma vez que fatores apropriados de reparo têm sido identificados, o próximo passo é selecionar a via apropriada para entregar às células, para gerarem tratamentos viáveis de doenças e envelhecimento. O desenvolvimento de “genes espertos”, os quais são hábeis em alterar a quantidade de proteínas por eles expressas baseadas na mudança de condições celulares, objetiva o aumento da eficácia do reparo de DNA e das argumentações sobre essa revolucionária terapêutica.

Ao contrário, múltiplos mecanismos endógenos de reparo de DNA, reparo gênico ou correção gênica, referem-se à forma de uma terapia gênica, a qual precisamente objetiva e corrige mutações cromossômicas responsáveis por desordens. É feito então pela troca da sequência quebrada de DNA com a sequência desejada, usando técnicas tais como mutagênese dirigida a oligonucleotídeos. Mutações genéticas requerem reparos são normalmente herdados, mas, em alguns casos, eles podem ser induzidos ou adquiridos (assim como o câncer).

Defeitos no mecanismo de reparação são responsáveis por muitas desordens genéticas, incluindo:

• Xeroderma pigmentosum: Hipersensibilidade à luz do sol/UV, resultando num aumento do câncer de pele e envelhecimento precoce;^[83]
• Síndrome de Cockayne: Hipersensibilidade à UV e a agentes químicos;^[84]
• Tricotiodistrofia: Pele sensível e cabelos e unhas frágeis;^[85]

Retardo mental frequentemente acompanha as últimas desordens, sugerindo aumento na vulnerabilidade dos neurônios em desenvolvimento.

Outras desordens do reparo de DNA incluem:

• Síndrome de Werner;^[83]
• Síndrome de Bloom: hipersensibilidade a luz solar, alta incidência de malignização celular, especialmente leucemias;^[86]
• Ataxia Telangiectasia: sensibilidade à radiação ionizante e alguns agentes químicos.

^[87]

As doenças acima são frequentemente chamadas de “progerias segmentais” (doenças do envelhecimento precoce) porque suas vítimas aparentam ser anciãs e sofrem de doenças relacionadas ao envelhecimento numa idade que são muito mais novas do que elas de fato aparentam ser.

Outras doenças associadas com redução do reparo do DNA são anemia de Fanconi, câncer de seio e de cólon hereditários.^[88]

Os processos básicos de reparo de DNA são altamente conservativas entre os procariotos e eucariotos e até nos fagos (vírus que infetam bactérias); como também, grande quantidade de organismos, genomas e mecanismos de reparo complexos.^[89] A habilidade de catalisar numerosas proteínas nas estruturas principais para relevantes reações químicas tem dado um papel significativo na elaboração de mecanismos de reparo durante a evolução.^[90]

Os fósseis indicam que uma única célula viva principiava a proliferação no planeta, em algum momento durante o período pré-cambriano, embora não se reconheça quando a primeira vez que a vida moderna surgiu. Os ácidos nucleicos passaram a ser as únicas organelas a codificar a informação genética, requerendo mecanismos de reparo de DNA que em sua forma básica têm sido herdados pela todas as formas de vida existentes por seus ancestrais semelhantes. A emergente atmosfera terrestre rica em oxigênio (conhecida como "grande evento de oxigenação") devido aos organismos fotossintetizantes, como também a presença de potenciais danos por radicais livres na célula devido à fosforilação oxidativa, necessitavam evoluir os mecanismos de reparo DNA que atuam especialmente para combater os tipos de danos induzidos por estresse oxidativo.

Em algumas situações, os danos de DNA não são reparados, ou é reparado por um mecanismo propenso a erros que resultam em uma alteração segundo a sequência original. Quando isto acontece, a mutação pode propagar dentro dos genomas da progenia da célula. Tal acontecimento deve em uma linha germinal celular que pode eventualmente produzir um gameta, a mutação tem o potencial de ser passado para o organismo descendente. A velocidade das evoluções nas espécies em particular (ou, em um gene em particular) é uma função da taxa de mutação. Como uma conseqüência, a velocidade e a precisão dos mecanismos de DNA influenciam sobre os processos de mudança evolucionária.^[91]

Uma tecnologia nomeada de CRISPR-Cas9 ((do inglês Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats), ou seja, "Repetições Palindrômicas Curtas Agrupadas e Regularmente Interespaçadas") foi descoberta em 2012. A nova tecnologia possibilita qualquer pessoa com conhecimento em biologia molecular a alterar os genes de quaisquer espécies com precisão.^[92]

• Mutação somática

• A comprehensive list of Human DNA Repair Genes
• 3D structures of some DNA repair enzymes
• Human DNA repair diseases
• Damage-Based Theories of AgingIncludes a description of the DNA damage theory of aging.
• DNA repair special interest group
• DNA Repair
• DNA Damage and DNA Repair
• Segmental Progeria
• Vegetables contain chemicals that boost DNA repair, Georgetown University Medical Center, February 9, 2006.
• Vegetables contain chemicals that boost DNA repair, British Journal of Cancer, February 13, 2006.

• Portal da biologia