BCA-Test
Der BCA-Test ist eine biochemische Methode, um Proteine unter Verwendung von Bicinchoninsäure (BCA) quantitativ zu bestimmen.
Der BCA-Test ist eine biochemische Methode, um Proteine unter Verwendung von Bicinchoninsäure (BCA) quantitativ zu bestimmen.
Prinzip
[Bearbeiten | Quelltext bearbeiten]An die Peptidbindung binden zweiwertige Kupferionen und werden bei alkalischem pH-Wert zu einwertigen Kupferionen reduziert. In Anwesenheit von BCA bilden die Kupferionen mit BCA einen blau-violetten Farbstoffkomplex. Bicinchoninsäure ist im alkalischen pH-Wert stabil, wodurch im Gegensatz zum Lowry-Test ein Arbeitsschritt weniger notwendig ist.[1] Die Nachweisgrenze ist vergleichbar mit dem Lowry-Test.[1] Weiterhin ist der BCA-Test weniger störanfällig gegenüber den Chaotropen Harnstoff und Guanidiniumchlorid, gegenüber den Salzen Ammoniumsulfat und Cäsiumhydrogencarbonat und gegenüber den Tensiden Triton X-100, SDS, Brij 35, Lubrol, CHAPS, CHAPSO und Octylglucosid.[1]
Die Reagenzlösung besteht aus den Stammlösungen A (10 g/L Natriumbicinchoninat, 20 g/L Natriumcarbonat, 1,6 g/L Natriumtartrat, 4 g/L Natriumhydroxid, 9,5 g/L Natriumhydrogencarbonat, auf einen pH-Wert von 11,25 mit Natriumhydroxid eingestellt) und B (40 g/L Kupfersulfat-Pentahydrat) in einem Mischungsverhältnis von 50 zu 1.[2] Die grünliche Reagenzlösung wird vor Gebrauch frisch aus den Stammlösungen angesetzt.[2] Die Probe wird 1:50 mit der Reagenzlösung verdünnt und 30 Minuten bei 60 °C erhitzt.[2] Der entstandene lila Farbstoff wird durch Photometrie bei einer Wellenlänge von 562 nm quantifiziert.[2] Während bei Raumtemperatur vor allem die Aminosäuren Cystein, Cystin, Tryptophan und Tyrosin zweiwertige Kupferionen reduzieren, werden die Kupferionen bei 60 °C auch durch die Peptidbindung reduziert, wodurch das Messergebnis weniger von der Aminosäurezusammensetzung der jeweils gemessenen Proteine abhängt.[3]
Geschichte
[Bearbeiten | Quelltext bearbeiten]Der BCA-Test wurde 1985 von P. K. Smith und Kollegen veröffentlicht.[4] Er basiert auf dem Lowry-Test von 1951,[5] der wiederum auf die Biuret-Reaktion zur Proteinbestimmung von 1949[6] und das Folin-Ciocalteu-Reagenz von 1927 zurückgreift.[7] BCA ersetzt beim BCA-Test das Folin-Ciocalteu-Reagenz im Lowry-Test.[3]
Literatur
[Bearbeiten | Quelltext bearbeiten]- C. M. Stoscheck: Quantitation of protein. In: Methods in enzymology. Band 182, 1990, S. 50–68, PMID 2314256.
Einzelnachweise
[Bearbeiten | Quelltext bearbeiten]- ↑ a b c John M. Walker: The Protein Protocols Handbook. Springer Science & Business Media, 2008, ISBN 978-1-603-27259-9, S. 11.
- ↑ a b c d Alfred Pingoud: Arbeitsmethoden der Biochemie. Walter de Gruyter, 1997, ISBN 978-3-110-16513-5, S. 152.
- ↑ a b Olsen BJ, Markwell J: Assays for the Determination of Protein Concentration. In: Current Protocols in Protein Science. 2007, S. 14–17 (englisch, wiley.com [PDF]).
- ↑ P. K. Smith, R. I. Krohn, G. T. Hermanson, A. K. Mallia, F. H. Gartner, M. D. Provenzano, E. K. Fujimoto, N. M. Goeke, B. J. Olson, D. C. Klenk: Measurement of protein using bicinchoninic acid. In: Analytical biochemistry. Band 150, Nummer 1, Oktober 1985, S. 76–85, PMID 3843705. doi:10.1016/0003-2697(85)90442-7.
- ↑ Oliver H. Lowry et al.: Protein measurement with the Folin phenol reagent. In: J. Biol. Chem. Band 193, Nr. 1, 1951, S. 265–275. PMID 14907713. PDF ( vom 29. September 2007 im Internet Archive).
- ↑ A. G. Gornall, S. J. Bardawill, M. M. David: Determination of serum proteins by means of the biuret reaction. In: J Biol Chem. Band 177(2), 1949, S. 751–766. PMID 18110453.
- ↑ Folin, O., und Ciocalteu, V.: On tyrosine and tryptophane determinations in proteins. In: Journal of Biological Chemistry. 73. Jahrgang, 1927, S. 627 (englisch, jbc.org [PDF]).